Os índios Botocudos dominaram a área da floresta do Rio Doce, que se estendia de Colatina até São Mateus, além de parte de Minas Gerais, por aproximadamente três séculos. A primeira incursão portuguesa no Rio Doce ocorreu por volta de 1572, liderada pelo desbravador Sebastião Fernandes Tourinho, que buscava alcançar Minas Gerais. Entre 1572 e 1921, os Botocudos resistiram bravamente contra os colonizadores, engajando-se em lutas ferozes. A partir de 1921, com o desenvolvimento de Colatina e sua emancipação política de Linhares, os Botocudos começaram a desaparecer. A onda de povoamento da Região Norte intensificou-se a partir da construção da Ponte Florentino Avidos, em 1928.A história relata que Colatina começou a ser colonizada 37 anos após o desembarque de Vasco Fernandes Coutinho, donatário português, na Capitania do Espírito Santo, em 23 de maio de 1535. Esse desembarque ocorreu na atual Prainha de Vila Velha, onde ele fundou o primeiro povoado. Como era o período da Oitava de Pentecostes, Coutinho batizou a terra de Espírito Santo, em homenagem à terceira pessoa da Santíssima Trindade.

Para colonizar a região, Vasco Coutinho dividiu a capitania em sesmarias, terras que deveriam ser cultivadas para fomentar a agricultura e a produtividade. Esses lotes foram distribuídos entre os 60 colonizadores que o acompanharam. No entanto, Vila Velha não oferecia muita segurança contra os ataques dos índios locais. Em 1549, Coutinho encontrou um local mais seguro numa ilha montanhosa, onde fundou Vila Nova do Espírito Santo, que mais tarde passou a ser conhecida como Vila Velha. Em 8 de setembro de 1551, após uma grande vitória contra os índios, a localidade foi renomeada para Vila da Vitória, data considerada a fundação da cidade.

Durante seus 25 anos como donatário, Vasco Coutinho realizou diversas obras importantes. Além da construção das duas vilas, ergueu as primeiras igrejas locais: a Igreja do Rosário, fundada em 1551, e a Igreja de São João, ambas em Vila Velha.

Os primeiros engenhos de açúcar também foram construídos, tornando-se o principal produto econômico por três séculos, até ser substituído pelo café em 1850. Em 1551, o padre Afonso Brás fundou o Colégio e Igreja de São Tiago, que, após várias reformas, tornou-se o atual Palácio Anchieta, sede do governo estadual.

A chegada dos missionários resultou na fundação das localidades de Serra, Nova Almeida e Santa Cruz em 1556. Dois anos depois, a vinda de frei Pedro Palácios levou à construção do Convento da Penha, o principal monumento religioso do Estado, dedicado a Nossa Senhora da Penha, padroeira do Espírito Santo.

Nos primórdios da colonização de Colatina, a cruz e a espada simbolizavam a presença europeia, representando a fé cristã e o poderio militar. Houve frequentes conflitos pela posse das terras no Vale do Rio Doce, entre a Vila de Regência, em Linhares, e Aimorés, em Minas Gerais. A resistência dos índios Botocudos transformou a região em um bloqueio natural contra os invasores europeus, especialmente durante o ciclo do ouro.

Os colonizadores portugueses utilizaram a Igreja Católica, por meio da ação dos jesuítas e franciscanos, para catequizar os índios e fornecer assistência religiosa aos colonos e suas famílias. O colonizador português, responsável pela disseminação do idioma e da fé católica, buscava explorar, plantar e produzir nas terras, deixando uma herança cultural visível nas cantigas de roda, brincadeiras infantis, vestimentas, culinária e arquitetura. Entre 1572 e 1821, a região de Colatina passou por diversos reveses, tanto positivos quanto negativos, sob a colonização portuguesa.

Sebastião Fernandes Tourinho, junto com Francisco Bruza de Espinosa e Martim de Carvalho, foi um dos primeiros exploradores europeus a percorrer as terras que hoje pertencem aos estados do Espírito Santo e Minas Gerais. As regiões onde hoje se encontram os municípios de Linhares, Colatina e Baixo Guandu tinham como porta de entrada natural o Vale do Rio Doce. Fernandes Tourinho subiu o rio Doce até sua origem, formada pela união dos rios Piranga, do Carmo e Xopotó, próximo ao município de Ponte Nova, em Minas Gerais.

Historiadores relatam que Tourinho teria entrado no rio Doce por Linhares, rumo às regiões ricas em pedras preciosas e ouro, próximas de Vila Rica. No entanto, ele encontrou resistência dos índios Botocudos na região onde hoje está Colatina, o que o obrigou a recuar e buscar uma nova rota para Minas Gerais.

Somente após 1650, incentivados pelos reis de Portugal, as incursões dos desbravadores europeus nos territórios mineiros se intensificaram, movidas pelos rumores da existência de eldorados no interior do Brasil. Essas expedições, no entanto, tinham como objetivo principal a descoberta de ouro e pedras preciosas e a captura de índios para escravidão, sem interesse em se fixar nas terras descobertas.

Em torno de 1692, o desbravador português Antônio Rodrigues Arzão, acompanhado por cinquenta companheiros, percorreu a bacia do rio Doce em sentido contrário e chegou ao Espírito Santo, onde estabeleceram-se em Linhares, que mais tarde originaria a Vila de Colatina, em 1821.

No século XVIII, as matas densas da região de Colatina eram ocupadas pelos Botocudos, uma tribo indígena nômade de guerreiros bravos que viviam principalmente da caça. Eles foram perseguidos e aniquilados por sua resistência, com alguns sobreviventes sendo escravizados pelo governo. Hoje, descendentes dos Botocudos, conhecidos como Krenak, vivem em reservas no Vale do Rio Doce, em Minas Gerais, preservando alguns costumes de seus antepassados.